جداسازی و شناسایی برخی از باکتری‌های تجزیه¬کننده مواد نفتی از خاک‏های آلوده به مواد نفتی و بررسی توان رشد آن‌ها در حضور گازوئیل

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

کاربرد فراوان مواد نفتی در ایران سبب آلودگی بسیاری از زیستگاه‌ها به مواد نفتی شده است.  زیست‏ بهسازی و بهره‌گیری از باکتری‌ها در راستای کاهش آلودگی‏های نفتی روشی کم هزینه و سازگار با محیط زیست می­باشد. از اینرو، غربالگری باکتری‌های تجزیه­کننده ترکیب‌های نفتی از نمونه‏های آلوده به نفت منطقه بوشهر در محیط  کشت بدون کربن آلی انجام شد. در این پژوهش، 19 سویه باکتری گرم منفی به نام‌های PDB1-19 از نمونه خاک آلوده به مواد نفتی جداسازی شد و شناسایی جدایه­ها با بهره‌گیری از کیت‌­های تشخیصی و روش مولکولی نشان داد که آن‌ها شامل جنس‌ها و گونه­های باکتریایی Stenotrophomonas maltophilia، Ralstonia sp.، Vibrio sp.، Sphingobacterium sp.، Zymomonas sp.، Pseudomonas aeruginosa، Paracoccus sp.، Pantoea sp.، Achromobacter xylosoxidans ،Acinetobacter johnsonii ، Serattia odorifera، Pseudomonas alcaligenes، Entrobacter cloacae، Pseudomonas stutzeri و Chryseobacterium sp. می­باشند. کارآیی این سویه‏ها در ارلن­های دارای محیط کشت مایع حداقل، با حذف هر گونه منبع کربن و بهره‌گیری از گازوئیل به عنوان منبع کربن و انرژی، به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با کاربرد دو تکرار بررسی شد. در این بررسی تیرگی محیط کشت مایع در طول موج nm 600 در زمان‌های 0، 48، 168، 216 و 312 ساعت سنجیده شد و به عنوان شاخص رشد باکتری و تجزیه گازوئیل توسط باکتری اندازه‌گیری شد. آنالیز آماری نشان داد که فاکتورهای آزمایشی مانند سویه باکتری، زمان و اثر متقابل آن‌ها در سطح یک درصد معنی‏دار می‌باشد. این باکتری‌ها توانستند در حضور ترکیب‌های نفتی همانند گازوئیل به صورت چشم‌گیری رشد نمایند و از میان سویه‏های باکتری، سویه Chryseobacterium sp. اختلاف معنی­داری با دیگر سویه­ها از لحاظ رشد در حضور گازوئیل داشت و با گذشت زمان (اندازه‌گیری پنجم) رشد آن بیشتر شد، نتایج اثر متقابل باکتری و زمان نیز نشان‌دهنده این یافته بود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and Identification of Oil-Degrading Bacteria from Oil-Polluted Soils and Assessment of Their Growth in the Presence of Gas Oil

نویسندگان [English]

  • Mitra Ebrahimi
  • Alireza Fallah
  • Mohammad reza sarikhani
چکیده [English]

Oil contamination in Iran due to high application of oil compounds, is one of the most dangerous pollution factors. Bioremediation is a prime strategy for remediation, by which the pollutants can be removed by making use of microorganism or any biological process that employes microorganisms or their enzymes to rehabilitate the environment altered by the contaminants. With regards to the importance of this method, screening and isolation of oil-degrading bacteria from contaminated site of Bushehr province were done in Carbon Free Minimal Medium enriched by gas oil. In this study 19 isolates of bacteria (PDB 1-19) were isolated, and the molecular and kit identifications showed different genus and species such as Stenotrophomonas maltophilia, Ralstonia sp., Vibrio sp., Sphingobacterium sp., Zymomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus sp., Pantoea sp., Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter johnsonii, Serattia odorifera, Pseudomonas alcaligenes, Entrobacter cloacae, Pseudomonas stutzeri and Chryseobacterium sp.. In order to determine the efficiency of these bacteria in hydrocarbon-degradation an inoculum of pure culture of bacteria containing 108 cfu/ml was used in liquid assay, which was performed in factorial experiment based on completely randomized design with 2 replications. Utilization of hydrocarbon sources was again detected in CFMM broth supplemented with 2% gas oil where the growth turbidity (OD600nm) as an indicator for utilization of hydrocarbon and bacterial growth was measured at different times of 0, 48, 168, 216 and 312hr. Results showed that in CFMM broth assay all main factors including bacteria and time as well as their interaction were significant (p<0.01). These bacteria were effectively able to mineralize gas oil and among bacteria, best results was achieved by Chryseobacterium sp.. The ability of bacterial isolates for degradation of oil-compounds increased by increasing time of incubation.
t;*� fr@�C D-family: Calibri;mso-bidi-font-family:"B Yagut";mso-bidi-language:FA'>Sphingobacterium sp.، Zymomonas sp.، Pseudomonas aeruginosa، Paracoccus sp.، Pantoea sp.، Achromobacter xylosoxidans ،Acinetobacter johnsonii ، Serattia odorifera، Pseudomonas alcaligenes، Entrobacter cloacae، Pseudomonas stutzeri و Chryseobacterium sp. می­باشند. کارآیی این سویه‏ها در ارلن­های دارای محیط کشت مایع حداقل، با حذف هر گونه منبع کربن و بهره‌گیری از گازوئیل به عنوان منبع کربن و انرژی، به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با کاربرد دو تکرار بررسی شد. در این بررسی تیرگی محیط کشت مایع در طول موج nm 600 در زمان‌های 0، 48، 168، 216 و 312 ساعت سنجیده شد و به عنوان شاخص رشد باکتری و تجزیه گازوئیل توسط باکتری اندازه‌گیری شد. آنالیز آماری نشان داد که فاکتورهای آزمایشی مانند سویه باکتری، زمان و اثر متقابل آن‌ها در سطح یک درصد معنی‏دار می‌باشد. این باکتری‌ها توانستند در حضور ترکیب‌های نفتی همانند گازوئیل به صورت چشم‌گیری رشد نمایند و از میان سویه‏های باکتری، سویه Chryseobacterium sp. اختلاف معنی­داری با دیگر سویه­ها از لحاظ رشد در حضور گازوئیل داشت و با گذشت زمان (اندازه‌گیری پنجم) رشد آن بیشتر شد، نتایج اثر متقابل باکتری و زمان نیز نشان‌دهنده این یافته بود.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioremediation
  • Gas oil
  • Minimal Medium
  • Molecular identification
  • Oil-degradation bacteria

مقدمه

خاک یکی از سرمایه‌های ارزشمند طبیعت بوده و به عنوان پالاینده طبیعی بشمار می‌آید. اما مدت‏ها است که مواد نفتی و مشتقات آن پس از برداشت، ترابری و نگهداری در انبارها یا بهره‌گیری نادرست موجب آلودگی خاک شده است (عبدالسلام و همکاران 2009، اسپارکس 2003). نفت خام ترکیب پیچید­ه­ای است و شامل هیدروکربن‏های زنجیره‏ای ساده، زنجیره‏ای شاخه‏دار و یا زنجیره‏ای حلقوی (ساده و آرو­ماتیک) می‏باشد (پاریش و همکاران 2005، سرنیگلیا 1992، آدام و همکاران 2002، کلارک 1986). بهسازی و کاهش آلودگی از خاک‏های آلوده یکی از گام‏های پایه‌ای در داشتن محیط زیست سالم و پایدار می‏باشد، چرا که آلاینده‏های گوناگون با کاستن منابع در دسترس، تولید را با آسیب‌هایی جبران ناپذیر روبرو می‏سازند. گسترش علم و دانش بشر و توجه به بهبود شرایط زیست‌محیطی و نیز کاربرد بهینه از امکانات محیطی، پژوهندگان را بر آن داشته تا روش‏های مناسبی را برای از بین بردن این آلودگی‏های زیانبار ارزیابی کنند. یکی از روش‏های بازیابی این مناطق و وارد نمودن آن‌ها در چرخه کشاورزی، کاهش و زدودن آلاینده‏ها با روش‏های زیستی یا غیر زیستی است که از این میان روش تجزیه زیستی با توجه به بهره‌گیری از توان طبیعی و توانایی‏های نهفته طبیعت بیشتر مورد توجه بوده است (انیفید و همکاران 2007).

 زیست‌بهسازی به عنوان راهکاری شایسته برای بهسازی خاک‏های آلوده می­باشد. زیست‏‌بهسازی یک واژه همه گیر برای زدودن و کاهش آلودگی محیط زیست با فرایندهای بیولوژیکی و به کمک ریزجانداران و بویژه باکتری، قارچ و مخمر در خاک‏ها و آب‌های آلوده می­باشد (مینایی تهرانی و همکاران 1384). مهمترین عامل در انجام زیست‌‏بهسازی، دست­یابی به جدایه­های میکروبی فعال در تجزیه مواد آلاینده می­باشد (زانگ یانگ 2007). باکتری‌های گرم مثبت به ویژه Bacillus sp. در فرایندهای زیست‏بهسازی کارایی ویژه‌ای دارند (گانش و لین 2009). گروه گسترده‌ای از باکتری‌ها همانند گونه‏های Pseudomonas،Acinetobacter ،Alcaligenes ، Nocardia  وRhodococcus  توان تجزیه زیستی هوازی ترکیب‌های نفتی را دارند (انیفید و ابوبکر 2007، کااو 2007). از میان باکتری‌ها، باکتری Pseudomonas از جمله جنس­هایی است که بررسی‌های فراوانی بر روی آن برای تجزیه شمار فراوانی از ترکیب‌های نفتی از جمله آروماتیک­ها انجام گرفته است ( کااو و همکاران 2009، ساریخانی و همکاران 2011). در بررسی‌های گوناگون از باکتری‌های تجزیه‏کننده هیدروکربن‏ها مانند Arthrobacter، Alcaligenes، Acinetobacter، Achromobacter، Pseudomonas، Nocardia، Flavobacterium، Escherichia coli، Coryneforms و Bacillus درمحیط‏های آبی و خاکی آلوده نام برده شده است ( انیفید و ابوبکر 2007، کااو و همکاران 2009، کوساریک و امریتوس 2001، عباسی و شکویرات 2007، براتی و واسودوان 2001).

ویسن و همکارانش (1991) در بررسی خود گونه Alcaligenes denitrificans را شناسایی نمودند که توان تجزیه زیستی فلورانتن[1] به اندازه 3/0 میلی‏گرم در میلی‏لیتر در هر روز را داشت. این سویه باکتری همچنین توان تجزیه دیگر PAH[2]ها همانند پیرن و بنزوآنتراسن را نیز داشت. تجزیه ترکیبات مشابه دیگری مانند فلورانتن به کمک باکتری‌های دیگری مانند جنس Mycobaterium نیز گزارش شده است (کانالی و هارایاما 2000).

کالدینی و همکاران (1995) موفق به جداسازی گونه باکتری fluorescence  Pseudomonasشدند که قادر به بهره‌گیری از کریزن[3] و بنزوانتراسن[4] به عنوان منبع کربن و انرژی بودند. سوپاکا و همکارانش (2001) جداسازی و شناسایی باکتری تجزیه­کننده فنانترن به نام Sphingomonas را گزارش نموده و عنوان داشتند که این باکتری قادر به تجزیه ترکیبات حلقوی دیگر نیز می‌باشد.

همچنین باکتری‌هایی با قابلیت‌های متفاوت وجود دارند که می‌توانند دیگر مواد نفتی را تجزیه نمایند. باکتری سرما‌دوست گونه Rhodococcus جدا شده از آب زیرزمینی که قادر به رشد تحت دمای 4 تا 30 درجه سلسیوس بوده و قادر به تجزیه هیدروکربن‏ها همانند نفت خام، روغن دیزل و گازوئیل می‏باشد (هیووک و همکاران 2006).

در پژوهشی ابراهیمی‏پور و همکاران (1384) از یک چشمه آب شیرین در پیرامون دزفول یک سویه باکتریایی گرم مثبت بردبار در برابر شوری[5] جداسازی نمودند و گزارش کردند که آن سویه ترکیب‌های نفتی را را به شکل کارآمدی معدنی می­نماید. آن‌ها  سویه  یادشده را در ارلن‏های دارای محیط نفت به عنوان تنها منبع کربن و انرژی رشد دادند و ساخت زیتوده میکروبی که نشان دهنده تجزیه شدن نفت بود را در طول موج 650 نانومتر اندازه­گیری نمودند.

در پژوهش دیگری فلور باکتری‌های گرم مثبت تجزیه کننده فنانترن را امیر مظفری و همکاران (1385) در بندرهای امیر آباد و نوشهر بررسی کردند. آن‌ها برای این منظور از محیط پایه دارای ترکیب‌های معدنی، عناصر کمیاب و فنانترن برای کشت نمونه‌های آب برداشت شده از این بنادر استفاده کرده و پس از کشت‌های پی در پی در محیط‌های ویژه و انجام آزمون‌های اولیه و بیوشیمیایی، باکتری‌های گرم مثبت جدا شده را در حد جنس و گونه شناسایی کردند. آزمایش نشان داد که از ١٦ نمونه باکتری‌های گرم مثبت تجزیه کننده فنانترن جداسازی شده، ٩ نمونه آن از جنس باسیلوس و ٧ نمونه از جنس کورینهباکتریوم بوده است.

برای بهره‌مندی بیشتر از توان ریزجاندارن خاک در زدودن و کاهش آلاینده‏های نفتی، جداسازی و غربالگری باکتری‌های تجزیه­کننده مواد نفتی و به دنبال آن خالص­سازی، شناسایی و بررسی توان آن‌ها در تجزیه مواد نفتی گوناگون مورد توجه می‏باشد. در این راستا، این پژوهش با هدف جداسازی، خالص‏سازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‏کننده مواد نفتی از خاک‏های آلوده به مواد نفتی استان بوشهر و همچنین بررسی توان سویه‏ها در رشد و احتمالاٌ تجزیه مواد نفتی مانند گازوئیل در شرایط آزمایشگاه و تلاش برای گزینش سویه برتر انجام شد.

 

مواد و روش‏ها

نمونه­برداری و ساخت سوسپانسیون خاک

تعداد 20 نمونه خاک از عمق 30-0 سانتی‌متر زمین‌های آلوده به مواد نفتی در استان بوشهر گردآوری شد. برای ساخت سوسپانسیون میکروبی و غنی­سازی باکتری‌های نمونه نفتی از محیط حداقل بدون کربن (CFMM)[6]­­­­­­­­­ (سوپاکا و همکاران 2001) به گونه‌ای که در زیر شرح داده می­شود، بهره‌گیری شد. یک گرم خاک آلوده درون 25 میلی‌لیتر از محیط بالا در شرایط سترون درون ارلن مایر افزوده گردید و در شرایط دمای 28 درجه سلسیوس و تکان دادن با دور rpm 150 برای 24 ساعت انکوبه شد. بعد از ساخت سوسپانسیون میکروبی اولیه برای غنی‏سازی کشت میکروبی و جداسازی باکتری‌ها، مایه‌زنی 5 میلی­لیتر از سوسپانسیون میکروبی به 45 میلی‏لیتر از محیط کشت CFMM با 2 درصد از ماده نفتی (گازوئیل) انجام شد. شرایط تکان دادن و دمای انکوباسیون مانند بالا بوده و برای یک هفته انکوباسیون انجام پذیرفت. با  دیدن تیرگی و رشد باکتری، برای جداسازی و خالص­سازی باکتری‌های بومی تجزیه­کننده مواد نفتی اقدام به ساخت سری  رقت  از  نمونه­ها  گردید  و  از  رقت‏های مناسب

(5-10 تا 8-10) به میزان 100 میکرولیتر بر روی پلیت­های دارای محیط جامد CFMM به همراه ماده نفتی گازوئیل انتقال داده شد. پلیت­ها در دمای 28 درجه سلسیوس انکوبه شدند.

خالص­سازی و شناسایی باکتری‌ها

با دیدن رشد کلنی باکتری در درون پلیت­ها با توجه به ریخت‌شناسی کلنی باکتری‌ها و ویژگی‌هایی مانند ریخت، کناره، خشکی و رنگ کلنی­ها اقدام به جداسازی و خالص‏سازی باکتری‌های رشد یافته بر محیط CFMM شد. در جریان خالص­سازی باکتری‌ها و کشت آن‌ها از محیط نوترینت آگار بهره‌گیری شد و در پی آن آزمون‏های بیوشیمیایی مانند رنگ‏آمیزی گرم، رنگ‏آمیزی اسپور، آزمایش ساخت رنگ فلورسانس، آزمون اکسیداز، آزمون کاتالاز (شاد 1988، جرهاردت 2006) و انجام برخی آزمون‏های پیشرفته با کیت­های شناسایی شرکت Himedia انجام شد. برای بهره‌گیری از کیت شناسایی باکتری از کشت تازه باکتری‌ها استفاده شد، برای این کار از تک کلنی باکتری کشت شده (شبانه) در محیط NB استفاده شد و سپس مایه‌زنی دوباره از رشد شبانه باکتری‌ها در محیط NB جدید انجام پذیرفت تا در مدت 4-3 ساعت OD پدید آمده از رشد باکتری‌ها به حدود 8/0 برسد. سپس 50-40 میکرولیتر از آن روی کیت­ها گذاشته شد. برای بررسی نتایج برای 48-24 ساعت در داخل انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس گذاشته شد و داده‌های آن با جدول کیت مقایسه گردید.

شناسایی مولکولی باکتری‌ها در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری به صورت زیر انجام شد. برای شناسایی مولکولی باکتری‌ها به روش 16S rRNA از آغازگرهای عمومی 27F و 1492R خریداری شده از شرکت ژن فناوران استفاده شد (جدول 1). برنامه PCR  بکاررفته دارای 30 چرخه بود که در دستگاه ترموسایکلر Flexigene این چرخه‌ها شامل،  یک چرخه نخستین با دمای 95 درجه سلسیوس برای 4 دقیقه، در پی آن دمای 94 درجه سلسیوس برای 1 دقیقه، دمای 53 درجه سلسیوس (دمای پیوند آغازگر) برای 1 دقیقه و دمای فراوان شدن 72 درجه سلسیوس برای 1 دقیقه بود که در پایان یک چرخه اضافی دمای 72 درجه سلسیوس برای 10 دقیقه نیز انجام شد.  یادآور شود که برای انجام PCR از تک کلنی باکتری‌ها بهره‌گیری شد و بدین گونه از استخراج DNA ژنومی باکتری چشم پوشی شد. نوارهای پدیدارشده (نزدیک 1500 جفت باز) پس از ران شدن محصول PCR بر روی ژل آگاروز ریکاوری شدند و خالص­سازی DNA به کمک کیت Roche انجام پذیرفت. برای انجام همسانه‌سازی و توالی­یابی DNA از ناقل pTZR57R/T بهره‌گیری شد و واکنش پیوستن[7] در کنار این ناقل انجام شد. سپس فراورده بالا برای تراریختی یاخته‌های مستعد[8] E. coli DH5a بهره‌گیری شد. پس از انجام آزمایش‏های تائیدی مانند کلنی PCR، استخراج پلاسمید و هضم آنزیمی، توالی­یابی نمونه­ها انجام پذیرفت (سمبروک و راسل 2001). پس از توالی یابی نمونه­ها، توالی‌های مورد نظر در پایگاه اطلاعاتی NCBI[9] ، Blastn[10] شدند و به بررسی یافته‌های آن‌ها پرداخته شد.

بررسی کارایی در محیط مایع

برای انجام آزمایش و داشتن کشت تازه، در آغاز باکتری‌های مورد نظر روی محیط کشت جامد نوترینت آگار کشت داده شدند، سپس از تک کلنی برای مایه‌زنی محیط نوترینت مایع بهره‌گیری شد. از کشت‏های شبانه باکتری‌ها با تیرگی یکسان (OD=1)، 1 میلی‌لیتر از باکتری رشد یافته را درون ویال 5/1 میلی‌لیتر ریخته بعد در درون دستگاه سانتریفیوژ با دورrpm 4000 برای 3 دقیقه سانتریفیوژ کرده تا باکتری ته نشین شود (ماندری و لین 2007). پس از ته‌نشینی، محلول رویی را دور ریخته و ته‌نشست باکتری را با حدود 750 میکرولیتر محیط CFMM دوباره حل نموده و سپس به درون ارلن مایر250 میلی‌لیتری دارای 50 میلی‌لیتر محیط کشت CFMM دارای 2 درصد گازوئیل افزوده شد. برای بررسی کارآیی جدایه‏های باکتری در تجزیه زیستی گازوئیل از محیط مایع CFMM دارای گازوئیل استفاده شد. تمامی ارلن‏ها برای تقریباً دو هفته بر روی شیکر انتقال داده شدند و در  این مدت در زمان‌های گوناگون (0، 48، 168، 216 و 312 ساعت) اقدام به اندازه­گیری OD در 600 نانومتر شد (امتیازی 2005). آنالیز آماری داده‏های مربوط به آزمایش یادشده (آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی) با بهره‌گیری از نرم‌افزار MSTATC انجام پذیرفت.

 

        

جدول 1- آغازگرهای عمومی برای تکثیر بخش 16S rDNA باکتری‌ها.

دمای پیوند

توالی آغازگر

نام آغازگر

Tm:53

5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'

27F

 

5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3'

1492R

 


جدول 2- تجزیه واریانس داده‏های (تبدیل شده) توان رشد باکتری‌ها در محیط مایع حداقل دارای گازوئیل.

منابع تغییر

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

مقدار F

فاکتور باکتری

18

432/28

580/1

**544/44

فاکتور زمان

4

449/34

612/8

**868/242

اثر متقابل باکتری× زمان

72

346/16

227/0

**402/6

خطا

95

369/3

035/0

 

جمع

189

596/82

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

              ضریب واریانس: 78/20%،  **: معنی‏دار در سطح 1 درصد

 


نتایج و بحث

غربالگری، جداسازی و شناسایی باکتری‌ها

جداسازی و خالص­­سازی باکتری‌ها ­از 20 نمونه­ خاک مربوط به خاک‏های­آلوده ­منجر به شناسایی 19 جدایه شد. آزمایش­های اولیه نشان داد که همه باکتری‌ها گرم منفی، بدون اسپور و کاتالاز مثبت هستند و برخی از آن‌ها اکسیداز منفی و مثبت بعلاوه تعدادی دارای توان ساخت رنگدانه در محیط king-B می­باشند. شناسایی مولکولی به روش 16S rRNA انجام پذیرفت که در شکل 1 نمونه­ای از محصول PCR مربوط به تکثیر ژن رمزکننده این قطعه آورده شده است. افزون بر روش یادشده بهره‌گیری از کیت Himedia برای شناسایی باکتری‌ها نیز بهره گرفته شد که در شکل 2 آورده شده است. اطلاعات مربوط به باکتری‌های شناسایی شده در این تحقیق در جدول 3 آورده شده است که شامل 15 جنس­ و گونه باکتریایی گوناگون به نام‌های Stenotrophomonas maltophilia، Ralstonia sp.، Vibrio sp.، Sphingobacterium sp.، Zymomonas sp.، Pseudomonas aeruginosa، Paracoccus sp.، Pantoea sp.، Achromobacter xylosoxidans ،Acinetobacter johnsonii ، Serattia odorifera، Pseudomonas alcaligenes، Entrobacter cloacae، Pseudomonas stutzeri، Chryseobacterium sp. می‌باشد.

در این بررسی برای جداسازی گونه­های باکتریایی توانمند تجزیه‏کننده مواد نفتی از خاک‌های آلوده، از محیط کشت حداقل بدون منبع کربن CFMM استفاده شد که در آن مواد نفتی مناسب جایگزین منابع کربن حذف شده از محیط گردید. لذا برای این منظور از ماده نفتی گازوئیل به میزان یک درصد و نهایتاً دو درصد به عنوان منبع هیدروکربنی و محیط CFMM جامد برای تهیه محیط کشت باکتری‌ها استفاده شد. چون محیط حداقل مورد استفاده عاری از هر گونه منبع کربن بود و گازوئیل به عنوان تنها منبع هیدروکربنی در این محیط محسوب می‌شد، لذا می‏توان گفت که باکتری‌هایی که قدرت بقاء و بهره‌گیری از گازوئیل در این محیط را داشته باشند توانایی رشد را خواهند داشت. بهره‌گیری از چنین روشی در کارهای دیگر محققان نیز دیده می‌شود به صورتی‌که سوپاکا و همکاران (2001) با بهره‌گیری از محیط کشت CFMM و بهره‌گیری از فنانترن به عنوان منبع کربن توانستند باکتری Sphingomonassp را از خاک‏های آلوده به مواد نفتی جداسازی ­نمایند. هیووک و همکاران (2006) با بهره‌گیری از محیط کشت حداقل [11]BH وگازولین یا روغن دیزل به عنوان منبع کربن در این محیط، باکتری Rhodococcus sp. را از آب­های زیرزمینی آلوده به مواد نفتی جداسازی نمودند.

لیانگلی و هونگچن (2009) گزارش کردند که باکتری‌های Pseudomonas stutzeri و Pseudomonas aeruginosa قادر به تجزیه زیستی فنانترن می­باشند و باکتری‌های Stenotrophomonas maltophilia وPseudomonas alcaligenes قادر به تجزیه فلورانتن هستند. سوزئو و همکاران (2009) نشان دادند که باکتری از جنس Achromobacter sp. و Chryseobacterium sp. قادر به تجزیه زیستی کربازول می­باشند و باکتری Pseudomonas stutzeri قادر به تجزیه پیرن، باکتری Ralstonia sp. قادر به تجزیه نفتالین و دی بنزوآنتراسن می­باشد.

یوسفی کبریا و همکاران (2009)  با جداسازی و بررسی ویژگی‌های باکتری‌های تجزیه کننده روغن دیزل از خاک‌های آلوده به این مواد گزارش کردند که باکتری بومی Bacillus نسبت به دیگر میکروارگانیسم­های خاک نقش مهمی در زیست بهسازی روغن دیزل دارد و گونه جداسازی شده با نام B. cereus توانایی تجزیه روغن دیزل را به میزان 20/85 درصد دارا می‌باشد.

اکوه و همکاران (2001) با جداسازی گونه Burkholderia cepacia از خاک‌های آلوده به نفت خام سنگین در نیجریه و بررسی توانایی آن در تجزیه زیستی اینگونه مواد  نشان دادند که این باکتری توان بهره‌گیری از نفت خام سنگین به عنوان منبع کربن آلی را دارد،  همچنین فراوانی این باکتری در مدت زمان 15 روز از  CFU/ml105 به CFU/ml 108 افزایش یافت.

کارایی تجزیه گازوئیل

برای بررسی کارایی جدایه‏های به دست آمده در استفاده و تجزیه هیدروکربن‌های نفتی از مقایسه میزان تیرگی یا کدورت پدید آمده از رشد آن‌ها در محیط کشت مایع حداقل دارای گازوئیل، بهره‌گیری شد. میزان تیرگی پدید آمده در محیط کشت پس از زمان یاد شده، نمایانگر میزان رشد باکتری است. از آنجایی که تنها منبع کربن آلی این محیط، گازوئیل (با نسبت 2% حجمی) است، بنابراین افزایش تیرگی نشان دهنده رشد و تغذیه باکتری‌ها از گازوئیل است. نتایج آنالیز آماری نشان داد که فاکتورهای باکتری، زمان و اثر متقابل آن‌ها (باکتری´ زمان) در سطح 1% معنی­دار می­باشند (جدول 2). مقایسه میانگین فاکتورهای معنی‏دار به روش دانکن نشان داد که با گذشت زمان بهره‌گیری از گازوئیل به عنوان تنها ماده کربنی در محیط افزایش می‏یابد و تجزیه این ماده رشد بیشتر باکتری را به دنبال دارد.

 

جدول 3- باکتری‌های شناسایی شده و برخی از ویژگی‌های آن‌ها.

باکتری

شکل باکتری

رنگامیزی گرم

تست اسپور

تست اکسیداز

تست کاتالاز

ایجاد رنگدانه

پس از تکمیل شناسایی

(مولکولی و بیوشیمیایی)

PDB1

کوکوباسیل

-

-

-

+

-

Stenotrophomonas maltophilia

PDB2

کوکوباسیل

-

-

+

+

-

Ralstonia sp.

PDB3

باسیل

-

-

+

+

+

Vibrio sp.

PDB4

باسیل

-

-

+

+

-

Sphingobacterium sp.

PDB5

کوکسی

-

-

-

+

-

Zymomonas sp.

PDB6

باسیل

-

-

+

+

+

Pseudomonas aeruginosa

PDB7

باسیل

-

-

+

+

-

Paracoccus sp.

PDB8

کوکسی

-

-

+

+

-

Sphingobacterium sp.

PDB9

باسیل

-

-

+

+

+

Pantoea sp.

PDB10

باسیل

-

-

+

+

-

Achromobacter xylosoxidans

PDB11

باسیل

-

-

+

+

+

Pseudomonas aeruginosa

PDB12

کوکسی

-

-

-

+

-

Acinetobacter johnsonii

PDB13

کوکسی

-

-

-

+

-

Acinetobacter johnsonii

PDB14

کوکوباسیل

-

-

-

+

-

Serattia odorifera

PDB15

کوکوباسیل

-

-

+

+

+

Pseudomonas alcaligenes

PDB16

باسیل

-

-

-

+

-

Entrobacter cloacae

PDB17

باسیل

-

-

+

+

+

Pseudomonas aeruginosa

PDB18

باسیل

-

-

+

+

+

Pseudomonas stutzeri

PDB19

کوکوباسیل

-

-

+

+

+

Chryseobacterium sp.

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- محصول PCR بدست آمده تکثیر ژن رمزکننده 16S rDNA. نردبان مولکولی با اندازه بین 100 تا 10000 جفت باز (LM)، محلول دارای تمام اجزاء واکنش به جز DNA باکتریایی (MM) و نمونه­­های باکتری با نام­گذاری PDB1-9.

 


 

 

 

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- نمونه­ای از کیت شناسایی باکتری Himedia بکاررفته در این آزمایش. تصویر بالایی پیش از مایه‌زنی و تصویر پائین پس از مایه‌زنی کشت باکتری می­باشد.

 

 

از میان اثرات متقابل (ترکیب تیماری باکتری´ زمان) بالاترین میانگین‌ها مربوط به زمان پنجم اندازه گیری (312 ساعت) بود. با توجه به جدول 4 مشاهده می‌شود که با گذشت زمان  کدورت پدید آمده از رشد باکتری در محیط افزایش می‌یابد به صورتی‌که کمترین میزان آن در زمان‌های ابتدایی آزمایش (زمان صفر و 48 ساعت) و با گذشت زمان بر مقدار آن افزوده شده است و تفاوت معنی‌داری بین زمان‌های 168، 216 و 312 ساعت از نظر آماری وجود دارد. این نتایج در مقایسه اثر ساده فاکتور زمان نیز به دست آمد (شکل نشان داده نشده است). از میان باکتری‌ها بیشترین رشد و به عبارتی استفاده از گازوئیل مربوط به باکتریAcinetobacter johnsonii  سویه PDB13 بود (366/2OD:) که بعد از 312 ساعت انکوباسیون حاصل شد (جدول 4). ترتیب قرارگیری باکتری‌های دیگر در همین مدت زمان به صورت زیر بود هرچند میان آن‌ها ناهمانندی چشم‌گیری با Acinetobacter johnsonii PDB13دیده نشد، به ترتیب باکتری‌های Entrobacter cloacae، Chryseobacterium sp.، Pseudomonas aeruinosa PDB11، Pantoea sp. و Achromobacter xylosoxidans با کدورتهای برابر با 231/2، 002/2، 922/1، 687/1 و 607/1 در این رتبه بندی قرار گرفتند. در این میان کمترین رشد و تجزیه در حضور گازوئیل برای باکتری‌های Stenotrophomonas maltophilia، Ralstonia sp، Sphingobacterium sp. و Paracoccus sp. به دست آمد (جدول 4).

قابل ذکر است که در این آزمایش از دو سویه Acinetobacter johnsonii به نام‌های PDB12 و PDB13 استفاده شد که سویه PDB13 دارای بالاترین رشد بعد از گذشت 312 ساعت در میان باکتری‌ها بود. روند تغییرات رشد این دو باکتری تا زمان سوم مشابه هم بوده و تفاوتی مشاهده نمی‌شود اما در زمان‌های 216 و 312 ساعت سویه PDB13 رشد چشم‌گیری از خود نشان داد. این موضوع در ارتباط با سویه‌های Pseudomonas aeruginosa نیز مشاهده شد به صورتی‌که بین سویه PDB11 و PDB17 در هیچ یک از زمان‌های پنجگانه اختلافی آماری مشاهده نشد اما سویه PDB6 تنها در زمان پنجم با دو سویه دیگر این باکتری رشد کمتری را نشان داد (جدول 4).

از میان باکتری‌هایی که توان استفاده از گازوئیل را به عنوان منبع کربن داشتند و رشد مطلوبی را نشان دادند (Acinetobacter johnsonii PDB13،  Entrobacter cloacae، Chryseobacterium sp.، Pseudomonas aeruinosa PDB11، Pantoea sp. وAchromobacter xylosoxidans) در همه آن‌ها به جز Acinetobacter johnsonii PDB13 رشد باکتری در زمان چهارم و پنجم اختلاف معنی‌داری را نشان نداد اما در مورد این باکتری رشد باکتری در زمان چهارم کاهش چشم‌گیری نسبت به زمان پنجم داشته است. این در حالی است که از میان همین باکتری‌ها، بیشترین رشد (583/1OD:) در زمان چهارم (216 ساعت) مربوط به باکتری Chryseobacterium sp. بوده است. آنچه از یافته‌های این پژوهش برمی‌آید آن است که از میان دیگر باکتری‌ها، باکتری  Chryseobacterium sp. توان بیشتری برای رشد بر روی ماده نفتی مورد آزمایش دارد و این مطلب با مشاهده رشد این باکتری در زمان‌های سوم (465/1OD:)، چهارم (583/1OD:) و پنجم (002/2OD:) با توجه به جدول 4 قابل استنباط می‌باشد.

        


 

جدول 4- میانگین رشد باکتری‌ها (چگالی نوری) در محیط مایع در حضور گازوئیل (اثر متقابل باکتری در زمان).

312 ساعت

216 ساعت

168 ساعت

48 ساعت

زمان صفر

باکتری

m-q (015/0) 047/0

m-q(009/0) 044/0

o-q (020/0) 026/0

q (004/0) 01/0

q (001/0) 011/0

Stenotrophomonas maltophilia

m-q (002/0) 061/0

m-q (008/0) 058/0

q (005/0) 016/0

q (008/0) 012/0

q (003/0) 015/0

Ralstonia sp.

i-q (183/0) 565/0

l-q (033/0) 294/0

l-q (130/0) 201/0

m-q (006/0) 061/0

n-q (002/0) 034/0

Vibrio sp.

m-q (054/0) 094/0

n-q (044/0) 036/0

o-q (021/0) 027/0

n-q (015/0) 036/0

q (004/0) 018/0

Sphingobacterium sp.

i-r (060/0) 411/0

n-r (034/0) 073/0

o-r (009/0) 053/0

p-r (007/0) 046/0

qr (009/0) 036/0

Zymomonas sp.

e-m (159/0) 009/1

j-r (014/0) 569/0

k-r (076/0) 536/0

m-r (078/0) 278/0

r (002/0) 019/0

Pseudomonas aeruginosa PDB6

o-r (024/0) 05/0

o-r (050/0) 066/0

r (025/0) 024/0

r (007/0) 018/0

r (004/) 018/0

Paracoccus sp.

c-i (278/0) 397/1

e-m (045/0) 931/0

f-q (098/0) 869/0

p-r (007/0) 044/0

o-r (0) 053/0

Sphingobacterium sp.

a-f (304/0) 607/1

e-m (264/0) 978/0

f-r (147/0) 81/0

o-r (003/0) 059/0

qr (009/0) 032/0

Pantoea sp.

a-e (204/0) 687/1

f-n (137/0) 884/0

g-r (042/0) 783/0

o-r (043/0) 057/0

r (0) 027/0

Achromobacter xylosoxidans

a-d (217/0) 922/1

c-k (100/0) 266/1

c-l (046/0) 213/1

o-r (014/0) 069/0

r (002/0) 02/0

Pseudomonas aeruginosa PDB11

e-m (056/0) 946/0

i-r (011/0) 624/0

k-r (057/0) 551/0

p-r (012/0) 042/0

qr (002/0) 032/0

Acinetobacter johnsonii PDB12

a (258/0) 336/2

b-h (143/0) 516/1

f-o (129/0) 877/0

o-r (016/0) 05/0

qr (008/0) 038/0

Acinetobacter johnsonii PDB13

c-k (098/0) 258/1

f-p (227/0) 873/0

f-r (118/0) 566/0

n-r (007/0) 099/0

o-r (003/0) 067/0

Serattia odorifera

b-n (183/0) 507/1

h-r (127/0) 762/0

m-r (083/0) 357/0

o-r (019/0) 065/0

o-r (006/0) 051/0

Pseudomonas alcaligenes

ab (347/0) 231/2

b-n (2/0) 474/1

i-r (104/0) 611/0

o-r (022/0) 059/0

n-r (013/0) 075/0

Entrobacter cloacae

d-l (214/0) 203/1

c-k (463/0) 311/1

c-k (206/0) 334/1

qr (023/0) 033/0

r (018/0) 028/0

Pseudomonas aeruginosa PDB17

c-j (185/0) 376/1

f-n (069/0) 88/0

i-r (108/0) 65/0

r (002/0) 026/0

p-r (034/0) 041/0

Pseudomonas stutzeri

a-c (155/0) 002/2

b-g (185/0) 583/1

b-h (120/0) 465/1

qr (014/0) 037/0

p-r (005/0) 044/0

Chryseobacterium sp.

(اعداد داخل پرانتز انحراف معیار می‌باشد)

 

 

کیریمورا و همکاران (1999) موفق به جداسازی سویه Sphingomonas sp. شدند که قادر به بهره‌گیری از کربازول و دیگر ترکیب‌های نفتی مانند n – هگزادکان بود. نتایج آزمایش آن‌ها نشان داد که با تغییر میزان OD محیط و افزایش رشد باکتری میزان تجزیه مواد نفتی افزایش می‌یابد. امتیازی و همکاران (2005) نیز تجزیه ترکیبات گوناگون نفتی را به وسیله سویه Pseudomonas در مدت زمان 9 روز از طریق منحنی رشد باکتری (OD600nm) بررسی نمودند، سویه یادشده از مواد نفتی موجود به عنوان منبع کربن و انرژی بهره‌گیری نموده و بیشترین رشد (OD) حدود 8/0 در فاصله زمانی 5 روز در حضور ماده نفتی اکتادکان و دودکان نشان داد این در حالی بود که بیشترین رشد باکتری در حضور ماده نفتی اکتان تنها  28/0 OD600nm= بود.


نتیجه‌گیری کلی

نخستین گام در بهره­گرفتن از توان میکروبی خاک برای بهسازی زیستی آلاینده­های آلی غربالگری و شناسایی آن‌ها می­باشد. در این پژوهش با غربالگری باکتری‌ها در محیط حداقل بدون کربن و جایگزین نمودن آن با مواد نفتی 19 سویه باکتری جداسازی و خالص­سازی شد. شناسایی باکتری‌ها به روش مولکولی و تست‏های بیوشیمیایی تکمیلی نشان داد که باکتری‌های گوناگونی جداسازی شده­اند که بیشتر از گروه باکتری‌های گرم منفی هستند. پس از بررسی توان رشد 19 سویه باکتری در محیط دارای گازوئیل، نتایج نشان داد که بالاترین رشد باکتری و شاید تجزیه گازوئیل در زمان انجام آزمایش مربوط به سویه گرم منفی Chryseobacterium sp. با رنگدانه زرد مایل به قهوه‌ای و با کلنی‌های کروی شکل می‏باشد. این سویه از لحاظ رشد و شاید تجزیه گازوئیل در زمان‌های سوم، چهارم و پنجم دارای رشد بالایی بود هر چند با برخی از باکتری‌ها از قبیل Acinetobacter johnsonii PDB13، Entrobacter cloacae، Pseudomonas aeruinosa PDB11، Pantoea sp. وAchromobacter xylosoxidans در برخی از زمان‌های ذکر شده تفاوت چشم‌گیری نشان نداد.



[1]Fluoranthene

[2]Polyaromatic hydrocarbons

[3] Chrysene

[4] Benz[a]anthracene

[5] Halotolerant

[6] Carbon Free Minimal Medium

[7] Ligation reaction

[8] Transformation of competent cell

[9] National center for biotechnological information

[10]Basic local alignment search tool (for Nucteotide)

1 Bushnell Hass

ابراهیمی پور غ، امینیان م و ابوالحسنی سورکی ع، 1384. جداسازی یک باکتری‌ هالوتولرانت نفت‌خوار و بررسی اثر فاکتورهای محیطی در تجزیه زیستی نفت خام به منظور حفظ محیط زیست. مجله علوم محیطی. شماره 8. صفحه های 74-65.
امیرمظفری ن، نوری ن و صفری ر، 1385. فون باکتری‌های گرم مثبت تجزیه کننده فنانترن از آبهای بنادر امیرآباد و نوشهر و مقایسه آن‌ها از نظر اصلاح زیستی. علوم و تکنولوژی محیط زیست. شماره 29. صفحه های 101-108.
مینایی­تهرانی د، حرفت منش  ع، و آذری دهکردی ف، 1384. مطالعه تجزیه زیستی نفت خام سنگین در خاک با مقیاس پایلوت. مجله علوم محیطی. شماره 10. صفحه های 82-71.
 Abbassi BE and Shquirat WD, 2007. Kinetics of indigenous isolated bacteria used for ex-situ bioremediation of petroleum contaminated soil. Environment Science 2(6): 761-766.
Abd-Elsalam HE, Hafez EE, Hussain AA, Amany GA and Hanafy AA, 2009. Isolation and identification of Three- rings polyaromatic hydrocarbons (Anthracene and phenanthrene) degrading bacteria. American- Eurasian Journal of Agriculture and Environment Science 5(1): 31-38.
AdamG, Gamoh K, Morris D and Duncan H, 2002. Effect of alcohol addition on the movement of petroleum hydrocarbon fuels in soil. The Science of the Total Environment 286(1-3):15-25.
Barathi S and Vasudevan N, 2001. Utilization of petroleum hydrocarbon by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum contaminated soil. Environment International 26: 413-416.
Caldini G, Cenci G, Manenti R and Morozzi G, 1995. The ability of an environmental isolate of Pseudomonas fluorescens to utilize chrysene and other four- ring polynuclear aromatic hydrocarbons. Applied Microbiology and Biotechnology 44: 225-229.
Cao B, Nagarajan K and Cheeloh K, 2009. Biodegradation of aromatic compounds: current status and opportunities for bimolecular approaches. Applied Microbiology and Biotechnology 85: 207-228.
Cerniglia CE, 1992. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation 3: 351-368.
Clark RB, 1986. Marine Pollution. Oxford University Press. USA
Emtiazi G, Shakarami H, Nahvi I and Mirdamadian SH. 2005. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas sp. and transformed Escherichia coli. African Journal of Biotechnology 4(2): 172-176.
Ganesh A and Lin J. 2009. Diesel degradation and biosurfactant production by Gram- positive isolation African Journal of Biotechnology 8(21): 5847-5854.
Gerhardt P, 2006. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology. Washington, D.C.
Heewook R, Joo YH, Youn-Jooan and Sukcho K, 2006. Isolation and characterization of Psychrotrophic and halotolerant Rhodococcus sp. Yhlt-2. J. Microbiology and Biotechnology 16 (4): 605-612.
Kanaly RA and Hrayama S, 2000. Biodegradation of high – Molecular- Weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria. Journal of Bacteriology 182(8): 2059-2067.
Kirimura K, Nakagawa H, Tsuji K, Kazuya M, Kurane R and Usami S, 1999. Selective and continuous degradation of carbazole contained in petroleum oil by resting cells of Sphingomonas sp. CDH-7. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 63(9): 1563-1568.
Kosaric N, 2001. Biosurfactants and their application for soil bioremediation. Food Technology and Biotechnology 39(4): 295-304.
Liangli J and Hungchen B, 2009. Surfactant mediated biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Materials 2: 76-94.
Mandari T and Lin J, 2007, Isolation and characterization of engine oil degrading indigenous microorganisms n Kwazulu- Natal, South Africa. African Journal of Biotechnology 6(1): 023-027.
Okoh A, Ajisebutu S, Babaloa G and Trejo-hernandez MR. 2001. potential of Burkholderia cepacia RQ1 in the biodegradation of heavy crude oil. International Microbiology 4: 83-87.
OnifadeAK and Abubakar FA, 2007. Characterization of hydrocarbon- degrading microorganisms isolation from crude oil contaminated soil and remediation of the soil by enhanced natural attenuation. Research Journal of biological sciences 2(1): 36-40.
Parrish Z, Banks D, Katherine Schwab M and Paul A, 2005. Assessment of contaminant liability during phytoremediation of poly cyclic aromatic hydrocarbon impacted soil. Environmental Pollution 137: 187-197.
Sambrook J and Russell DW, 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sarikhani MR, Ebrahimi M and Fallah AR, 2011. Comparison of hydrocarbon-degradation by isolates of Pseudomonas fluorescens Chao, P. putida P13 and Pantoea agglomerans P5 in presence of gas oil, toluene and phenanthrene. 4th International Conference on Environmental Industerial and Applied Microbiology, 14-16 September, Malaga, Spain.
Schaad NW, 1988. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. 2nd edition, APS Press. St.Paul, MN, USA.
Sparks DL, 2003. Environmental Soil Chemistry. 2nd edition. Academic Press. USA.
Supaka N, Pinphanichakam P, Pattaragulwanit K, Thaniyavah S, Omori T and Juntonggjin K, 2001. Isolation and characterization of a phenanthrene degrading sphingomonas sp. Strain P2 and its ability to degrade fluoranthene and pyrene via cometabolism. Research Article Science Asia 27: 21-28.
Suseo J, Sookeum Y and li QX. 2009. Bacterial degradation of aromatic compounds. International Journal Environment Research Public Health 6: 278-309.
Weissenfels WD, Beyer M, Klein J and Rehm HJ, 1991. Microbial metabolism of fluoranthene: isolation and identification of ring fission products. Applied Microbiology 34: 528-35.
Yousefi kebria D, Khodadadi A, Ganjidoust H, Badkoubi A and Amoozegar MA. 2009. Isolation and characterization of a novel native Bacillus strain capable of degrading diesel fuel. International Journal of Environment Science and Techniques 6(3): 435-442.
Zongqiang GK, Berndt- Michael A and Peijumli W, 2007. Activated carbon adsorption of PAHs from vegetable oil used in soil remediation. Journal of Hazardous Material 143(2): 372-378.